一、測試原理：

過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛（MDA）可與硫代巴比妥酸（TBA）縮合，形成紅色產(chǎn)物,在532nm處有最大吸收峰。因底物為硫代巴比妥酸（ThibabituricAcidTBA）所以此法稱TBA法。

二、測試所需儀器耗材和試劑：

含532nm波長的分光光度計(jì)(上海美析儀器有限公司)及1cm光徑比色皿（或酶標(biāo)儀及96孔板）、95℃水浴鍋、電爐（配試劑加熱用）、臺式低速離心機(jī)、各種規(guī)格移液器、雙蒸水、無水乙醇、生理鹽水（0.9%）或PBS（0.1M）、冰醋酸（分析純，乙酸濃度≥99.5%）、渦旋混勻器、離心管、蛋白測定試劑（組織及細(xì)胞樣本用，本公司有售）。

三、試劑盒組成與配制:(試劑盒有效期1年)

四、規(guī)范操作方法：

1、樣本前處理：

血清（漿）樣本：直接使用；

細(xì)胞培養(yǎng)液樣本：取部分3500rpm/分鐘離心10分鐘后取上清待測；

組織樣本：稱取組織重量，按照重量（g）:體積(mL)=1:9的比例加入9倍體積生理鹽水，剪碎組織，冰水浴制備成勻漿液待測（勻漿液也可3500rpm/分鐘離心10分鐘后取上清（10%勻漿上清）測定，此時上清液需要同時測定其蛋白濃度，計(jì)算時用公式（3））；

培養(yǎng)細(xì)胞樣本：

收集細(xì)胞：①、懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，可直接通過離心收集沉淀細(xì)胞（1000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，棄上清留沉淀細(xì)胞）；②、貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，吸去上清，可通過細(xì)胞刮直接將細(xì)胞刮下；或者是用0.25%的胰酶室溫消化2～3分鐘，加培養(yǎng)液終止消化，用微量移液器輕輕吹打，將所有液體吸出轉(zhuǎn)入EP管，然后1000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘棄上清，留沉淀細(xì)胞，再加入1mLPBS輕輕吹打，再次1000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘棄上清，留沉淀細(xì)胞待用。如暫時不做，則可以將細(xì)胞低溫凍存，溫度越低越好。

細(xì)胞破碎：（以下任選一種）（破碎后可以用本所的BCA或考馬斯亮藍(lán)試劑盒測定蛋白濃度，用于計(jì)算）

①、研磨破碎：在細(xì)胞沉淀中加入一定量（106數(shù)量級的細(xì)胞一般加0.3～0.5mL）的緩沖液（緩沖液可以用PBS或者是生理鹽水），用手動玻璃勻漿器冰水浴研磨3～5分鐘，或者是用卡富隆電動研磨器冰水浴研磨3分鐘待測；

②、超聲破碎：在細(xì)胞沉淀中加入一定量（106數(shù)量級的細(xì)胞一般加0.3～0.5mL）的緩沖液（緩沖液可以用PBS或者是生理鹽水），需保證超聲探頭在液面以下。功率300W，冰水浴，每3～5S超聲一次，間隔4次（每次間隔時間為30S左右）；（推薦此法）

③、反復(fù)凍融：可以用液氮進(jìn)行反復(fù)凍融，讓細(xì)胞在EP管或者是凍存管中加入一定量的低滲液或者蒸餾水，直接放入液氮中3～5秒，立即提出轉(zhuǎn)入-20℃冰箱（20～30秒），再取出室溫解凍，解凍后再按前面重復(fù)3次。（注意從液氮中取出不可直接置于室溫解凍，這樣EP管等容易炸裂導(dǎo)致樣本損失，所以一定要用冷凍進(jìn)行梯度解凍）；

④化學(xué)裂解：貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，可直接將上清吸去后，直接在孔板或是瓶中加入一定量的裂解液（推薦用1%-2%的TritonX-100，覆蓋滿細(xì)胞），置冰上裂解30～40分鐘（可用顯微鏡觀察細(xì)胞破碎情況，如效果不好可延長時間），再用微量移液器吸出待測。

2、操作表：

注：①、對照管每個樣本都需要做，表內(nèi)所有試劑可以按比例增大或縮小，結(jié)果不變。

②、細(xì)胞勻漿液或細(xì)胞培養(yǎng)上清液可上樣0.3～0.4mL。

③、規(guī)范操作方法標(biāo)準(zhǔn)管參考吸光度：標(biāo)準(zhǔn)管吸光度減去空白管的吸光度為0.130～0.140（1cm光徑），用酶標(biāo)儀讀數(shù)時，此值在0.075～0.090。

④、預(yù)試時，若發(fā)現(xiàn)檢測樣本吸光度太低，正式實(shí)驗(yàn)時可以將水浴時間40分鐘延長至80分鐘，但同一課題中MDA的水浴都必須用80分鐘，以免造成批間差異。

3、計(jì)算公式：

（1）、血清（漿）、細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量計(jì)算公式：

（2）、組織中MDA含量計(jì)算公式：

（3）、細(xì)胞或組織勻漿上清中MDA含量計(jì)算公式：

注：